多乐游戏银商:抗体偶联药物（ADC）生物分析策略

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　　抗体偶联药物（ADC）结构具有异质性并且DAR值在体内呈动态变化, 除了脱偶联的游离抗体和游离载荷外，还存在不同程度与小分子药物偶联的ADC分子，因此，对ADC生物分析方法的开发带来很大挑战。 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应 (ELISA) 和液相色谱-质谱分析 (LC-MS)。ADC同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体 (anti-therapeutic antibody, ATA)，影响其药效、药动学及安全性，因此也有必要评价其免疫原性。

　　今天为大家解读一篇关于ADC药物生物分析相关的文章。以期为大家在ADC药物生物分析方法开发方面提供参考，促进ADC药物安全有效地开发。

　　与其他治疗药物一样，ADC的开发要建立暴露-效应关系，以指导从早期发现到临床阶段的研发决策。由于ADC同时包含大分子（单克隆抗体）和小分子（毒性载荷与连接子）的双重特性，其生物分析相较于其他生物治疗药物更复杂，需要整合多种分析技术才能全面理解其动态变化的特性。ADC生物分析面临诸多挑战：其异质性混合物特性通常表现为体内药物抗体比率（DAR）的动态变化（图1），储存稳定性问题等。这一些因素使得分析监测组分的选择和组分解析变得复杂。鉴于ADC设计的具体方案的日益多样化，最相关分析物及其技术可行性仍具挑战。本文将系统探讨生物分析科学在ADC候选物筛选、转化及临床开发中的战略整合应用，从而深入解析决定ADC疗效与毒性的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）及生物分布驱动因素。

　　图1 体循环中ADC的DAR值随时间变化以及总抗体、ADC、偶联载荷及非偶联载荷的典型药代动力学特征

　　目前ADC的新型设计（位点特异性、新型连接子与载荷）不仅深化了对ADC稳定性、载荷释放和药代动力学特性的认知（图1），还推动了新型生物分析技术的建立，例如采用免疫沉淀-质谱联用技术（IP-MS）通过完整蛋白分析测定DAR。配体结合分析法（LBA）和液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）仍是分别表征和定量大小分子组分的核心平台。根据ADC候选物的研发阶段特点，采用整合式生物分析策略，以此来实现资源优化配置并指导下游生物分析支持方案（包括合规路径与外包策略）。

　　在新型连接子-载荷发现的早期阶段，一般都会采用LC/MS方法定性分析主要释放组分通，这既能指导构效关系（SAR）研究，又能为后续候选物的分析策略提供相关依据。为阐明暴露-反应关系，ADC候选物的生物分析通常包括：采用LBA方法定量血清总抗体（tAb）、ADC（抗体偶联载荷）及抗治疗抗体（ATA），并通过LC/MS技术监测未偶联载荷水平（表1）。早期发现阶段可能缺乏需数月制备的定制抗载荷试剂，此时可结合tAb与完整蛋白DAR分析获得药代动力学（PK）决策数据。细胞毒性载荷（通常为抗有丝分裂或DNA损伤机制类）属小分子（1kDa），适用于成熟的小分子LC/MS分析。若连接子化学特性允许（如酸裂解或酶裂解连接技术），可通过离体载荷裂解步骤测定抗体偶联载荷水平（更能准确反映循环中活性/毒性ADC）。不可裂解连接子因设计特性难以直接测量偶联载荷水平。传统偶联策略（赖氨酸、铰链半胱氨酸）产生的ADC通常具有DAR分布范围广、稳定性低于现代位点特异性偶联技术的特点——后者通过将载荷连接子锚定于抗体骨架替代残基，可实现更均一、稳定的连接及更持久的DAR值。针对不一样的情况已开发出相应的生物分析方法。

　　合规生物分析的目的是支持注册申报所需的临床前毒理学研究及临床开发活动，为阐释疗效和毒性的暴露-反应关系提供相关依据。ADC药物其毒性与ADC或载荷浓度存在关联。ADC特异性生物分析问题一直受到监督管理的机构的重视。本文将聚焦现代生物分析方法在ADC新药研发全流程中的成功应用，确保其安全高效地通过各开发阶段直至获批上市。

　　生物分析始于ADC发现阶段，涉及新型载荷、连接子-载荷及偶联化学的优化，并包括结构完整性研究。载荷化学基团多样性、偶联方法、设计释放机制及潜在代谢途径对分析工作构成重大挑战。这些组分可通过质谱技术在体外环境中评估，以合理通量和效率促进早期发现阶段的构效关系（SAR）研究。此阶段筛选一般会用肝微粒体、肝S9组分或溶酶体组分进行，这些体系已被证明有助于预测临床前物种和人类的代谢特征。新型连接子-载荷的性能需在临床前药效、毒性和ADME评估实验中进一步验证。早期发现阶段可能尚未配备LBA所需的抗载荷试剂，因此可使用先进MS定量方法提供暴露评估及载荷代谢物信息。无论使用何种分析方法，检测前常常要复杂的样品前处理流程，必须确保整个处理过程中偶联物完整性得到验证。

　　尽管ADC在设计上需保持体循环稳定性，但由于整体不稳定性或肿瘤/组织环境中载荷释放后的再进入，未偶联载荷往往实际存在。必须定量检测体循环中未偶联载荷水平以评估药理活性形式的暴露风险。释放形式的特征（均含主要药效基团）取决于偶联化学和载荷特性，可能会产生各种连接子片段或载荷代谢物。未来连接子和偶联设计策略不仅需解决ADC循环稳定性问题，还应优化最强效载荷形式的递送。

　　对于某些新型连接子-载荷的发现研究，体内载荷释放特征往往较为复杂。需通过全面研究确定体内活性未偶联组分及相关代谢物，认识到各自可能具有独特毒理学意义。基于此分析，最好采用合成标准品对所有相关载荷实体进行完全定量。例如：不可裂解连接子产生的载荷将以连接子-载荷形式释放（通常为氨基酸衍生物形式）；若采用半胱氨酸-马来酰亚胺偶联，马来酰亚胺水解会在体内环境中产生环化半胱氨酸，需捕获两种同量异位素形式。还需注意不同临床前物种的释放特征有几率存在差异（如啮齿类与NHP血浆中羧酸酯酶表达和活性水平显著不同）。全面理解物种特异性释放及相对酶活性变化对评估预期临床特征至关重要。

　　确定释放实体后，常规采用成熟LC/MS/MS小分子定量方法检验测试未偶联载荷或连接子-载荷。适用于MS分析的样品前处理方法有液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）和蛋白沉淀（PPT），需格外的注意从生物基质中提取载荷的同时避免处理过程中意外释放。随后采用串联四极杆质谱进行仔细的检测，该方法具有宽动态定量范围、高灵敏度检测和高通量流线型数据处理特点。由于载荷通常高效力，LC/MS/MS的定量限需远低于其体外IC50值——但随着高效力载荷类型的迭代，实现这一目标的技术挑战日益增大。

　　ADC载药量程度（更重要的是偶联化学完整性）直接影响分子安全性与有效性，因此精准测量偶联载荷对评估ADC暴露和其他ADME属性至关重要。完整蛋白LC/MS分析可为此类评估提供足够细节和特异性，并具备充分定量能力。该方法有关键免疫沉淀（IP） 分析物分离步骤，随后经最小化后处理（如去糖基化和还原）后进行仔细的检测，可采用变性LC/MS或在天然条件下检测完整ADC。

　　完整ADC分析的通用生物分析流程如图2所示：首先通过免疫纯化提取ADC分析物（临床前物种可使用商品化二抗如抗人Fc抗体固相支持物捕获目标ADC）；经多次缓冲液冲洗去除基质后，使用酸性缓冲液洗脱ADC分析物；采用PNGase或EndoS进行去糖基化处理可减少ADC相关物种数量，降低质谱图复杂性并增强灵敏度；因流程需在室温或更高温度下长时间操作，可添加蛋白酶抑制剂最大限度减少ADC降解和载荷释放；最终通过蛋白LC和高分辨质谱（hrMS）分析洗脱的ADC。由于免疫亲和纯化提供了高纯度分析物，此时LC主要起脱盐作用而非色谱分离。hrMS离子源参数需针对大分子蛋白来优化，m/z扫描范围需覆盖完整蛋白电荷包络（包括完整抗体或轻/重链尺寸）。耗时的数据处理步骤最重要的包含去卷积以重构完整蛋白质量——最终获得的质量值（特别是重构峰强度）对去卷积参数设置敏感，需制定并遵循一致程序以确保结果重现性。

　　图2 用于ADC药物DAR测定的完整蛋白质LC/MS分析工作流程。关键步骤(小方框)按样品处理各阶段(大方框)顺序列出。

　　考虑到临床前阶段难以获得合适内标制备各DAR组分标准曲线，现行hrMS完整蛋白分析属于半定量方法。通常DAR值通过各DAR峰绝对测量值计算（如某些赖氨酸偶联物）：分别测量各偶联物对应峰强度；对于还原型ADC（如铰链区半胱氨酸），可单独检测轻链和重链（具有更高灵敏度和准确度）。DAR值为各偶联物种峰强度的算术平均值。

　　ADC的体外血浆稳定性可用于早期评估解偶联速率、连接子裂解甚至载荷代谢（偶联状态下）。理解体外稳定性特性及其他体外药理学数据有助于新型连接子-载荷的SAR研究，推动发现项目筛选需投入更多资源的临床前评价候选ADC。通过比较偶联系列（即相似连接子/载荷支架和偶联化学）中平均DAR随时间变化程度与类似ADC的体内稳定性，可确保相关性并验证该方法对特定ADC系列的有效性。该方法的作用在于：高度不稳定的ADC可在决策终止前避免投入更多资源的体内研究。

　　体外血浆稳定性评估可通过将ADC在相关物种新鲜血浆中孵育进行（包括ADC药效/毒理学研究物种及人血浆以理解种属差异）。孵育时间可根据自身的需求延长以区分系列ADC稳定性（需考虑血浆基质酶完整性），期间应监测并必要时调整血浆pH值。采集不同时间点样品后，可通过LBA检测tAb与ADC浓度差异，LC/MS/MS检测释放载荷出现情况，完整蛋白LC/MS分析DAR变化。

　　虽然未偶联载荷原则上贡献系统暴露量，但循环ADC水平（通过偶联载荷程度反映）最能代表靶点潜在活性剂。最新一代ADC血浆中未偶联载荷的曲线下面积（AUC）通常比偶联载荷低3-4个数量级，证明连接子稳定性明显提升。通常当对载荷代谢有一定认知且具备合适抗载荷试剂时，ADC水平（代表至少连接一个连接子-载荷的抗体）通过LBA测量。但LBA定量所有DAR物种可能面临诸多挑战，而基于LC/MS的分子精确方法（用于测定DAR和/或偶联载荷）可确认LBA实际测量内容。替代性且常互补的策略是通过LC/MS定量偶联载荷量：一种方法是用完整蛋白分析获得的DAR值结合tAb浓度计算偶联载荷（将LC/MS确定的载药比与各时间点摩尔单位tAb浓度相乘），该方法适用于早期发现和新型连接子-载荷筛选（尚未具备载荷检测试剂时）；另一种方法专适用于酶裂解连接子型ADC：通过连接子特异性蛋白酶孵育ADC释放载荷，再用LC/MS/MS直接测量释放载荷以获得抗体偶联载荷的药代动力学时程（必须确定该方法的重现性、释放效率和稳健性），一旦确定裂解物种并获得标准品，可应用于发现和开发全阶段；最后是替代肽段方法：通过适当酶解ADC实现绝对蛋白定量，该方法关键挑战在于需建立能产生定量相关偶联区域的酶解方案，方法开发需大量时间投入，更适合后期开发阶段（候选物数量较少时）。

　　如前所述，本方法通过完整蛋白LC/MS分析获得的DAR值和LBA定量的tAb计算偶联载荷（图3）。利用本文前述完整蛋白分析，可从药代动力学或毒代动力学（TK）研究中获得平均DAR谱。虽然该检测不能提供偶联绝对定量，但DAR评估可表征偶联变化，从而准确推导平均DAR。LBA测量的tAB提供抗体准确循环浓度。在任何时间点，偶联载荷量可通过该时间点平均载药比与摩尔抗体浓度相乘确定。该方法适用于所有采用不一样连接子-载荷和偶联化学的ADC，主要优点是：完整蛋白电荷包络的MS扫描可覆盖所有可能代谢转化，且分析多种ADC所需方法开发最少。

　　hrMS完整蛋白分析被视为半定量测量，其主要价值体现在临床前决策支持。应注意该方法灵敏度受限于完整蛋白LC/MS（低于更灵敏的LBA）。检测轻链和重链（替代完整ADC）可提供灵敏度优势。对于依赖抗体链间二硫键半胱氨酸的偶联，可采用非变性方法。需进一步开发以提高蛋白LC/MS性能重现性并加速数据处理去卷积过程，从而提升常规检测个体DAR谱的效率。

　　可裂解连接子的设计需在ADC循环过程中保持稳定，同时能在靶向细胞内作用位点高效释放载荷。采用可裂解连接子的ADC可通过多种机制释放载荷，包括pH敏感裂解、二硫键还原以及酶促裂解。载荷释放的选择性通过利用溶酶体中特定优势蛋白酶或内化过程中的特殊环境特征实现。分析方法中开发的裂解流程取决于ADC连接子的特性。

　　目前最广泛使用的可裂解连接子之一是Val-Cit-PABC（可被组织蛋白酶B裂解）。在对游离载荷进行MS分析前，可建立酶促裂解的样品处理程序。该方法利用小分子生物分析固有灵敏度远高于完整蛋白LC/MS的特点，采用特异且灵敏的LC/MS/MS分析策略获取偶联载荷PK或TK时程信息。对于采用酶裂解连接子（如Val-Cit-PABC）的ADC，可将血浆或血清样品与适宜酶（如组织蛋白酶B）在反应缓冲液中孵育，随后通过三重四极杆质谱仪定量释放的载荷组分。需首先评估释放载荷在反应体系中的稳定性（评估时长与酶孵育时间一致）。酶促释放效率常常要优化条件：若能达到近乎完全释放，采用载荷标准曲线就可以获得直接准确的结果；若裂解未完全优化，使用ADC本身作为标准曲线有助于补偿不完全释放的影响。

　　原则上，所得载荷水平被视为总载荷浓度（包含初始偶联和未偶联部分）。可通过扣除未偶联载荷（前文所描述的方法）获得偶联载荷浓度，或在偶联载荷释放步骤前通过固相萃取去除样品中未偶联载荷。多数情况下游离载荷浓度比偶联部分低数个数量级，因此对总偶联载荷浓度的贡献可忽略不计。

　　基于替代肽段测量的蛋白定量是成熟的分析方法。该方法也可应用于ADC偶联载荷分析（不受连接子-载荷化学特性限制）。该方法通过将ADC酶解为肽段片段，随后识别并定量含载荷偶联物的相关肽段，可在同一分析方法中高灵敏度测量载荷和tAb，并经方法验证支持下游开发。需格外的注意最大限度减少酶解过程对偶联完整性的影响，关键是要验证酶解效率是否受偶联影响，或通过实验设计考虑这种差异。tAb定量也可采用特征肽段策略，以此来实现tAb与偶联载荷的同时检测。

　　该方法主要挑战在于开发能捕获所有偶联区域并产生适宜定量肽段的酶解方案。对某些偶联化学（如传统铰链区半胱氨酸偶联和赖氨酸偶联），该挑战尤为突出：理论上赖氨酸偶联具有随机性，有几率发生在抗体多个赖氨酸残基上；但实际上偶联位点可能更多局限于溶剂可及性最高的赖氨酸残基，邻近残基和氢键也会影响赖氨酸偶联情况。近年采用的位点特异性偶联策略通过预定义少量偶联位点，为方法开发提供了更有利条件。

　　绝大多数ADC项目的临床前和临床研究仅采用LBA测定tAb和ADC浓度。这些分析方法成本低、通量高，尽管存在ADC异质性和传统不稳定性带来的分析挑战，仍能为ADC项目提供关键决策数据。当所需试剂可用时（通常处于ADC先导化合物优化阶段），LBA即可支持ADC临床前研究，此时给定连接子-载荷系列的结构变异性通常较小。多种传统LBA形式已用于ADC检测，包括抗原捕获法、使用抗独特型抗体的特异性夹心法以及使用抗人框架抗体的通用夹心法。所需分析方法的功能和数量取决于项目阶段及数据预期解决的问题性质。

　　tAb包含DAR值大于等于零的抗体（包括偶联、部分解偶联和完全解偶联的ADC形式）。tAb检验测试的数据与ADC数据结合可界定体循环中载荷解偶联程度，若缺乏LBA ADC或LC/MS偶联载荷分析方法，还可与LC/MS获得的平均DAR结合计算偶联载荷暴露量（如前述）。尽管临床中多数ADC会随时间解偶联，若不存在解偶联（即ADC稳定），仅用tAb分析即可描述ADC药代动力学特征，简化分析投入。

　　根据分析方法形式，ADC可作为抗体偶联药物或药物偶联抗体进行仔细的检测。两种方法的基础原理与挑战将在本文后续讨论。但两种形式均需要针对小分子载荷的特异性试剂（获取可能具有挑战性）。ADC免疫原性检测采用与其他生物治疗产品相似的桥联LBA方法。与其他生物治疗产品类似，ADC项目发现阶段通常不进行滴度测定、中和抗体（NAB）分析及免疫原性表位表征。但早期阶段常需区分针对抗体框架与针对ADC载荷的免疫原性。此外，许多载荷源于或类似天然产物，可能观察到预存反应性。

　　所有LBA均依赖特异性高亲和力试剂。ADC PK分析所需试剂包括重组靶点分子、抗体框架抗体、高特异性抗CDR（抗独特型）抗体及抗载荷抗体。部分靶点可商业获取，抗框架或抗物种抗体也有大量选择。但抗CDR和抗载荷试剂必须定制：虽然抗独特型抗体制备有明确成功路径，小分子细胞毒性载荷采用半抗原化方法的成功率更具开放性和不确定性。对于新型载荷或同类但结构显著改变的新载荷，现有试剂可能无交叉反应。尽管已实现制备能检测构象变化、异构体及羟基级修饰的超高特异性小分子试剂，但没办法保证一定能获得足够高亲和力和特异性的试剂以应对低剂量给药和偶联状态下载荷代谢的潜在复杂性。一定要通过LC/MS办法来进行新型载荷分解代谢/代谢研究，定性确定循环中活性偶联物种，以明确检验测试对象并指导试剂筛选方案和最终选择。试剂制备策略在大多数情况下要长期投入，即使成功制备，试剂也可能没办法在临床前项目早期获得。此时项目必须依赖本章前述其他办法来进行药代动力学分析。多克隆抗体可在项目早期投入不高时提供更快速经济的试剂制备途径。单克隆抗体有利于长期试剂管理的最佳实践，具有单表位、更高特异性及更稳定重复供应的优势。

　　ADC参考标准品通常与给药组分相同。与几乎所有其他生物治疗药物不同，ADC常为异质性混合物。虽然在项目后期这些标准品表征充分，但早期表征和稳定能力数据有限。从分析角度最关切的是：这些标准品很少能代表药代动力学研究样品（尤其是后期采样点）中实际存在的分析物种组合，可能会引起数据不准确。正如其他文献指出，这对定量生物分析构成重大挑战。为更好理解LBA分析的DAR敏感性，需要纯化或富集的DAR标准品。这对传统负载ADC极具挑战；但位点特异性偶联物可获得高度富集的DAR 2和DAR 4 ADC。虽已尝试从血浆中纯化体内来源的DAR 1和DAR 3组分，但操作困难且难以常规实施。制备这些DAR标准品的高投入限制了其在项目早期应用（此时可能需体内测试数十个ADC候选物）。

　　tAb检测可单独使用抗物种试剂（通用分析法）、抗原联合抗物种试剂或抗CDR抗体联合抗原/抗物种试剂完成。当没有办法获得足量抗原时，可采用细胞衍生或基于细胞的分析方法，但该方法验证通常比别的形式更具挑战。

　　这些分析方法开发和验证/确证的关键关注点在于：多重偶联位点可能会引起试剂结合的空间位阻。若发生此情况，可能会引起某些ADC形式（通常高DAR形式）的检测效率低于别的形式甚至完全解偶联抗体。这可能是由于表位掩蔽或空间阻碍。在tAb分析方法确证/验证过程中，可采用母本抗体制备的QC样品，结合DAR标准品测试上述现象出没出现。若母本抗体框架中引入位点特异性突变，则应使用该形式。需注意：体内解偶联过程中可能残留部分连接子，因此合成QC样品可能仍不能完美代表体内物种。

　　通用tAb分析法适用于临床前发现阶段（需评估大量ADC候选物）。但需确保单一tAb分析对应用中可能遇到的各种载荷偶联（DAR）不敏感。部分tAb分析法因与人IgG存在交叉反应不能用于人体研究，因此可能在GLP毒理学或FIP阶段要换掉分析形式/试剂。抗原捕获法具有优势（载荷药物不会干扰结合），可用于开发全阶段，但需要以合理成本获得重组靶点（通常为胞外域）。总体而言，尽管存在载荷干扰的额外挑战，这些分析方法通常可靠定量、高灵敏特异、宽动态范围且精密度准确度优异。

　　ADC分析检测偶联载荷的抗体（具有生物学相关性的物种，能向表达靶点的细胞递送载荷）。理论上ADC效力与DAR载量正相关，但验证该假设的公开数据有限。Hamblett等评估了传统半胱氨酸ADC偶联物的一系列纯化DAR物种（体外和体内），发现体外效力与DAR正相关而体内不然（可能因高DAR物种清除更快）。越来越明确的是：DAR和偶联位点影响疗效也可能会影响安全性。

　　采用LC/MS检测偶联载荷的应用日益增多（可提供摩尔单位的偶联载荷定量）。LBA也可能提供类似结果：曾采用竞争性LBA在卡奇霉素从ADC释放后检测总偶联卡奇霉素；Hussain等采用类似方法并以卡奇霉素当量表示数据。DAR敏感性ADC LBA也可提供此类数据，多种此类分析方法已用于支持ADC项目。DAR敏感性LBA形式几乎均基于抗体捕获结合载荷检测：抗体捕获步骤必须不受偶联载荷或DAR影响；理想情况下抗载荷检测试剂应与偶联药物分子数成比例结合。但该分析形式可能仅部分DAR敏感，且可能难以检测高DAR物种或载荷部分埋藏、溶剂可及性低或成簇的ADC物种。前者对传统偶联ADC最需要我们来关注——但通常给药溶液中高DAR物种（DAR 6和8）占比极低，且清除更快，对总体暴露贡献甚微。LBA定量可能足以支持基于暴露的效力和毒性认知。界定溶剂不可及位点已成为位点特异性ADC的最新研究领域（通过这一些位点偶联可提高稳定性）。可采用富集/纯化DAR参考标准品评估这些分析的DAR敏感性（方式同DAR不敏感ADC分析）。

　　多数ADC靶点为非脱落细胞膜靶点，理想情况下在恶性细胞高表达而非正常细胞表达。但临床中存在循环中高水平脱落靶蛋白的ADC案例，这可能降低ADC与靶细胞结合或改变ADC清除（循环复合物可能因ADC较长半衰期而累积，其他治疗性单抗的脱落和可溶性靶点也存在此现象）。脱落靶点存在还可能干扰PK分析和免疫原性分析中的ADC检测。这些考量对分析方法设计和数据解读均至关重要。

　　免疫原性分析及其在药物开发不同阶段的应用已有文献详尽阐述。免疫原性检测采用与其他生物治疗产品相似的桥联LBA方法。与其他生物治疗产品类似，ADC项目发现阶段通常不进行滴度测定、NAB分析及免疫原性表位表征投入，而是在开发过程中采用分级策略，ADC也采用非常相似的方法。桥联ATA分析用于初始筛查，这些分析可检验测试针对ADC所有元件的ATA。但项目早期常需区分针对抗体框架与针对载荷的免疫原性。此外，许多ADC载荷源于或类似天然产物，可能观察到预存反应性（设定cutoff值时需额外考量）。由于高水平药物和脱落靶点可能干扰ATA测量，阴性结果不一定表明ATA不存在。当发现阶段PK谱提示快速清除（尤其二次给药后清除快于首次给药）时，会对终末点样品进行ATA筛查。这一些数据常用于解释异常PK结果并解决早期多剂量设置（如探索性毒性评估）中的暴露问题。可能还需额外确定针对偶联载荷与抗体框架的反应性；但由于临床前免疫原性不能预测临床免疫原性，此阶段额外投入的理由需谨慎判断。

　　生物分布是ADC在临床和临床前研究中的关键属性，对清除率、毒性和疗效具有潜在影响。不同单克隆抗体的组织生物分布特征相似，这源于其相似的抗体生物物理特性。相比之下，ADC的连接子和载荷会赋予其不同于裸抗体的独特理化属性。载荷偶联通常会使整体极性向更强疏水性转变，因此导致生物分布特征的差异。

　　尽管抗体药物具有固有的长半衰期，但解偶联过程通常导致ADC清除率略高于相关tAb。ADC在非靶组织中的非特异性摄取可能促进解偶联过程，加速其清除。分布的另一个特征是靶向位点（如肿瘤）载荷的定量检测，这极有助于确立通过免疫相互作用递送药理活性实体的选择性特性，并为转化模型应用提供重要数据支持。

　　脱靶毒性可归因于载荷蓄积：既可能通过直接摄取自由循环的未偶联载荷，也可能通过ADC的非特异性摄取及随后在局部释放载荷。通过LC/MS/MS检测载荷生物分布可揭示毒性背后的机制。例如：采用可裂解连接子的ADC在非靶向骨髓中检测到高水平奥瑞他汀，表明游离载荷可能是导致该ADC观察到中性粒细胞减少症的原因。此类组织暴露信息可指导研究和克服剂量限制性不良反应的策略，以期扩大治疗窗。

　　根据具体研究问题，生物分布研究可采用以下分析方法支持：（1）放射性标记材料的ADC和载荷分布；（2）LBA检测tAb；（3）LC/MS/MS检测游离载荷。

　　从本质上讲，组织中的抗体水平通常仅为血浆中所发现的一小部分。采集时需用磷酸盐缓冲液（PBS）充分冲洗组织残留血液。组织和细胞结构的破坏会导致细胞内含物（可能包括溶酶体酶）释放，因此需在组织裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物，最大限度降低离体ADC降解风险。某些类型的连接子-载荷需进行pH调节与监控。组织裂解缓冲液还需与目标分析平台兼容（例如：高有机相含量适用于小分子LC/MS/MS分析，但不兼容LBA分析）。均浆上清液需经过进一步处理才能进行生物分析。对于基于细胞的测试（如体外系统样品），可通过相似程序收集细胞沉淀做多元化的分析。可采用温和的均质化程序（如快速冷冻、剧烈振荡或超声处理），但仍建议使用蛋白酶抑制剂。

　　为支持临床前合规毒理学及后续临床研究，药代动力学和ATA分析方法的开发需特别考量以满足监督管理的机构的分析方法验证和样品检测指南要求。此外，与所有生物制剂一样，在开发阶段转换过程中应尽可能减少分析方法或平台的变更。但ADC项目的生物分析投入通常在早期阶段更大（此时需比较多个ADC并确定其稳定性和ADME特性）；随着项目进入合规阶段，部分分析方法可能不再需要用于项目决策。先导化合物选择阶段的试剂投入有助于选择更合适的长期试剂，促进合规LBA开发。然而在向支持合规临床前毒理学研究过渡时，分析方法形式可能改变。例如：若临床研究需采用偶联载荷LC/MS分析法，而临床前使用LBA ADC分析法支持小鼠药代动力学和探索性毒理学研究，则应在合规TK研究中同时使用两种方法以衔接预期的分析方法转换。

　　在此阶段支持ADC项目时，通常可获取更多试剂，且需解决更多分析问题。为定量ADC并满足监管指南对方法验证的期望，建议采用前文所述的DAR不敏感性ADC LBA。这些分析方法通常使用抗载荷试剂捕获ADC分析物并检测抗体，原则上意味着它们对至少连接一个连接子-载荷的ADC分子与具有更多偶联载荷的ADC具有同等检验测试能力。在这一些方法开发过程中，建议在验证前分析评估中使用DAR标准品实验证明DAR不敏感性。根据偶联化学性质的不同，能否实现这一点仍存在不确定性。DAR 1标准品尤其难以制备，且难以确保其代表体内可能会产生的所有DAR 1物种（即不同偶联位点）。但仍应使用预期体内DAR范围内的富集DAR标准品来测试以确定分析方法性能，同时需认识到达标品质量、可用DAR标准品范围以及结果与PK样品相关性的局限性。例如：对于传统偶联ADC，较高DAR物种（DAR 6）在给药时占ADC群体比例很小，且通常快速清除或转化为较低DAR物种；因此，对DAR 8标准品回收过高或过低的分析方法，与完美回收此类高DAR标准品的分析方法相比，可能不会产生显著不同的Cmax或AUC数据。Myler等描述了三种LBA和两种LC/MS方法的开发与应用以支持合规研究：完全验证的tAb LBA、总ADC LBA、活性ADC LBA、偶联载荷LC/MS和未偶联载荷LC/MS分析法。该团队证明两种LBA ADC分析法均具有DAR敏感性，且活性LBA与偶联载荷分析法结果一致，进一步证实LBA ADC分析法能精准测量所有ADC DAR物种。这种ADC支持的整合方法为选择LBA ADC支持临床研究提供了分析依据，也表明可开发并验证DAR敏感性ADC LBA以支持合规研究。随着行业对多种ADC获得更多经验，预计将在独特分析方法验证问题及合规研究所需ADC PK分析方法的数量和类型上形成共识。

　　支持合规研究的未偶联和偶联载荷LC/MS分析方法验证基于小分子监管指南。这些分析方法的精密度和准确度技术方面的要求高于基于LBA的大分子分析方法，但考虑到ADC的相关挑战，行业建议未来指南应反映分析物的基本性质而非检测平台。

　　在合规研究中通过LC/MS测量未偶联载荷时，ADC稳定性是重要关注点（取决于偶联化学性质和载荷特性），因需要先分离样品中的ADC和载荷分析物。未偶联载荷水平清除迅速，在体循环中的浓度相对于高得多的偶联载荷（即ADC）水平通常极低，因此这些分析方法可能需达到pg/mL级的灵敏度。关键的是，必要的样品前处理步骤不得导致共存ADC释放任何载荷，否则将错误高估未偶联载荷水平。此外，未偶联载荷分析方法的灵敏度可能远高于ADC生产的基本工艺相关的药物产品放行检测的新方法要求；因此甚至有可能在参考物质中检测到未偶联载荷，使分析方法验证进一步复杂化。参考标准品应反映样品中的相关分析物，且在开始开发支持合规研究的分析方法前，需早期投入理解代谢和载荷释放过程。存在ATA时也也许会出现潜在并发症（根据采用的提取方法，可能对载荷回收产生不同程度影响）。此外，由于许多载荷源于天然产物，观察到预存载荷免疫反应性并不罕见，这也可能干扰回收。

　　满足当前FDA指南的挑战在于：在ADC存在下（偶联载荷浓度至少是未偶联载荷水平的1000倍）需要方法具有超高灵敏度。此外，由于ADC所载载荷的高效力特性，ADC剂量明显低于其他蛋白治疗药物，需要开发定量下限（LLOQ）低于其体外IC50的载荷分析方法（通常为数十至数百pg/mL水平）。随着偶联物稳定性提升和效力增强（如最新一代新型ADC），循环未偶联载荷水平可能进一步降低。

　　对于基于AcBut-卡奇霉素连接子-载荷的ADC，已应用偶联载荷分析法支持合规研究。如Hussain等报道，该方法利用体外二硫键还原步骤，随后进行PPT和SPE步骤，实现样品中总卡奇霉素的ELISA定量。最近Val-Cit二肽连接子在ADC设计中应用日益增多；该连接子适用于酶促裂解释放载荷，随后进行LC/MS/MS分析以支持申报临床的毒理学研究。

　　如非合规部分所述，免疫原性分析监管指南和为生物治疗药物制定的最佳实践已成功应用于ADC，采用相同的分级办法来进行筛查、确证、滴度测定和中和测试。使用明确界定的桥联分析法进行初始ATA筛查，目标是检测所有ATA反应。通常需确定ADC和潜在靶点的耐受性。该分析中的阳性样品随后进行确证分析。此外，可测试ATA针对抗体、载荷或两者兼具的域特异性。常用方法是通过添加过量未偶联抗体或药物实现此目的，也可使用域特异性试剂。阳性样品可进一步进行滴度测定。与其他生物治疗药物类似，需要临床中和性ADA分析。这一些数据可关联至PK以及安全性和疗效方面的临床影响。

　　除上述药代动力学和毒代动力学生物分析支持方法外，还可生成基于生物系统的生物测量数据，这一些数据对ADC转化研究同样至关重要。药代动力学/药效学（PK/PD）建模是一种实用技术，可定量整合不相同的领域的数据片段，从而揭示ADC疗效、毒性和生物分布的驱动因素。重要的是，这一些方法还能搭建临床前到临床的转化桥梁，最大限度提高优质ADC候选物进入临床评估的可能性，并通过基于模型的模拟验证假设。这一些方法的最终价值取决于数学模型包含的机制要素以及输入数据的质量。

　　从概念上讲，ADC经全身给药后必须到达肿瘤微环境，与肿瘤表面相关抗原结合，经历内化并运输至溶酶体（针对不可裂解连接子-载荷），最终裂解出足够细胞毒性载荷并分布至其药理靶点（如微管、DNA）结合。在证明临床前作用机制和构建适用于药物开发各阶段的模型化框架的过程中，围绕每个步骤可以生成有价值的结果。在药物发现阶段，理解差异受体表达和丰度（相对于正常组织）、表征ADC与细胞表面抗原的结合特性及定量内化和靶点回收速率具有指导意义。这一些信息与载荷效力和细胞外排知识结合，可判断任何给定靶点是否值得进一步投入。在ADC候选物选择和PCC阶段的下游环节，可整合组织水平模型预测细胞内载荷浓度和药物效应；结合预测的人体PK数据，可估算临床有效剂量范围。

　　制定一套最优的生物分析策略来支持所有ADC的发现与开发并非易事，因为每种方法都具有独特优势和局限性。成功推进ADC模式需要不同专业领域的生物分析专家（如LBA和小分子LC/MS领域）共同讨论，并寻求新方法来满足新一代ADC的独特需求。随着对患者疗效和安全性关键生物分析相关因素的新认知不断获得，以及分析技术的持续进步，加速ADC药物开发时间轴的能力很有几率会成为常态。通过与其他科学学科（化学家、生物学家、PK/PD建模师等）的协调交叉，一同推动ADC生物分析领域的技术和监管认知快速发展。

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