多乐游戏银商:Cell丨降低酯化APOE与LDLR的结合可以缓解阿尔兹海默症

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　　） 是一个由299个氨基酸构成的34-KDa的蛋白，包括1-167残基组成的N端结构域、铰链区和206-299组成的C端结构域。其中，N端结构域负责与受体结合，C端则负责脂质结合。APOE主要存在3种常见变异体，包括ε2 （APOE2） 、ε3 （APOE3） 和ε4 （APOE4） 。APOE3存在于约78%的人群，在阿尔兹海默症 （Alzheimer’s disease，） 研究中被认为是标准对照基因；APOE4约占14%；APOE2约占9%。这三种等位基因与AD的患病风险强相关。相比于APOE3，APOE4个体AD风险明显地增加，其纯合子个体甚至增加10-15倍 （详见BioArt报道：；；；；；） ；而APOE2携带者则将AD发生风险降低50%。另外，APOE也存在稀有突变，包括APOE3-Christchurch、APOE3-R145C、APOE3-Jacksonville和APOE4-R251G。APOE是大脑中最丰富的载脂蛋白，主要表达在星形胶质细胞和活化的小胶质细胞调节脂质代谢。星形胶质细胞分泌的新生APOE脂蛋白颗粒呈圆盘状，随后由LACT和表达在星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞的ABCA1酯化。APOE结合硫酸乙酰肝素蛋白多糖 （HSPGs） 募集脂蛋白，之后酯化APOE经过与LDLR和LRP1结合后内吞。随后，脂蛋白运输到晚期内体和溶酶体进一步降解回收，其中一部分APOE蛋白经逆胞吞作用 （retroendocytosis） 分泌。

　　既往研究之后发现APOE变异体与LDLR的亲和力不同，APOE2与LDLR的亲和力最低【1-3】。虽然APOE2纯合子可能与3型高脂蛋白血症有关，但是其对AD的潜在作用可能未受到足够重视。近期研究揭示APOE3-Christchurch （R136S） 同样对AD具有保护作用，可能通过降低与HSPGs和LDLR的结合有关【4,5】。这种APOE2和APOE3-Christchurch介导AD保护作用的背后机制尚不完全明确。

　　酯化APOE （lipAPOE） 暴露受体结合位点从而与LDLR结合。与既往研究一致，作者证实APOE变体与LDLR的亲和力相关，lipAPOE2的LDLR结合能力明显低于lipAPOE3和lipAPOE4。SPR和HTRF实验定量揭示这种结合差异，HTRF结果为lipAPOE3和lipAPOE4的EC50为13nM，而lipAPOE2的可检出结合为100nM；SPR结果为lipAPOE3-KD为16nM，lipAPOE4-KD为9nM，而lipAPOE2-KD为800nM。同样，将lipAPOE与pHrodo （pH敏感染料） 结合监测细胞内吞，结果显示lipAPOE2在5-6h和1d的内吞确实明显低于lipAPOE3/4，表明降低的细胞摄取。考虑到LDLR、LRP1和HSPGs均与APOE摄取有关，作者使用敲除模型、竞争性蛋白抑制剂和肝素处理模型发现只有LDLR影响细胞长期APOE摄取。总之，这些根据结果得出LDLR介导的APOE摄取与不同的APOE变体有关。随后，作者检测LDLR介导的lipAPOE摄取对细胞LDLR蛋白影响。结果显示lipAPOE2处理轻微增加膜和总LDLR水平。相反，lipAPOE3/4明显降低膜和总LDLR水平，然而，细胞内簇状LDLR密度则增加。APOE染色发现这些簇状LDLR与APOE共定位，且分布在LAMP+区室内。DIL-LDL吞噬实验表明lipAPOE3/4处理抑制细胞对LDL的吞噬。这些根据结果得出LDLR介导的APOE3/4摄取影响LDLR的再循环，导致LDLR限制在内体溶酶体进而抑制LDL的摄取。

　　由于中枢神经系统的脂蛋白类似高密度脂蛋白 （HDL） ，作者直接用pHrodo标记APOE-HDL监测不同变体对实际脂蛋白的摄取。结果显示对HDL的吸收能力APOE4~APOE3 APOE2，而LDLR的胞外域蛋白能抑制吸收，表明HDL的摄取依赖LDLR。同样，这种LDLR-介导的APOE变体导致的摄取差异也见于胆固醇酯 （cholesteryl ester，CE） 。APOE4~APOE3诱导的脂质摄取增加伴随胆固醇外排基因 （ABCA1和ABCG1） 的上调和合成基因 （HMGCR、SREBF2和DHCR7） 的下调，表明对胆固醇堆积的反应。脂质组学热图分析清晰地将APOE不同变体处理区分开来。相比于对照组，APOE3尤其是APOE4处理的细胞具有更多的CE和甘油三酯，而APOE2处理甚至降低CE，表明APOE变体对神经细胞脂代谢的调节差异。考虑到胆固醇堆积诱导小胶质细胞的炎性改变，作者通过RNA-seq分析证实相比于APOE2，APOE3和APOE4促进炎性细胞因子的表达，如IL-9、IL-13、IL-18和IFN-α2。尽管APOE3和APOE4具有相似的CE摄取，但APOE4处理诱导的上述炎症因子分泌也高于APOE3，表明APOE4有几率存在其他机制。总之，这些根据结果得出APOE3/4摄取促进脂质堆积并诱导炎性改变。

　　随后，作者检测APOE变体影不影响神经元脂褐素 （一种衰老相关的溶酶体病变） 的形成。在iPSC来源的神经元中，CE(20:4)-lipApoE处理诱导脂褐素的沉积，在程度上APOE4 APOE3 APOE2。APOE4的K146E突变 （APOE与LDLR和HSPG结合缺陷） 和LDLR胞外域蛋白均能抑制脂褐素的沉积，表明脂褐素的沉积需要LDLR介导的脂质内吞。后续实验进一步揭示胆固醇酯酰基侧链的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs） 、脂质过氧化和胆固醇酯的结构完整性对于脂褐素沉积的重要性。作者猜测，CE(20:4)-lipApoE4和CE(20:4)-lipApoE3的聚集差异可能是其在内吞相同条件下诱导脂褐素沉积不同的原因 （） 。37℃超速离心聚集实验发现CE(20:4)-lipApoE4和CE(20:4)-lipApoE2在酸性条件下聚集程度最高，而CE(20:4)-lipApoE3的聚集最低。这些根据结果得出APOE4的高摄取和高聚集促进脂褐素堆积，而APOE3虽然高聚集但低摄取减少了脂褐素堆积。

　　综上所述，这项研究揭示APOE3-Christchurch和APOE2变体对阿尔兹海默症的保护机制是通过抑制与其受体LDLR的结合进而减少内吞引起的脂褐素堆积和溶酶体功能受损，为理解APOE不同变体的致病差异和开发新的治疗策略提供证据。